正当哈布斯堡王朝的政策和反宗教改革变换波希米亚的宗教、政治和文化面貌之时，三十年战争在欧洲大部分地区蔓延，其中也包括了波希米亚王室的土地。作为欧洲最后一次重大的宗教战争，三十年战争由年的波希米亚起义引发，战火遍及这个大陆直到年，从布拉格的一次抛出窗外事件扩展为德国新教统治者与哈布斯堡家族的神圣罗马帝国皇帝及其天主教盟友组成的联盟之间的斗争。由此，贯穿它的四个发展阶段，三十年战争展现为牵涉欧洲几大王朝的权力斗争。
斐迪南二世得到了一名有经验的军事将领，波希米亚贵族阿尔布雷希特冯华伦斯坦（瓦尔德什泰恩）主动提出以2万名土兵支援这位皇帝的天主教事业。华伦斯坦是一名在兄弟会经营的学校中受过教育的没落贵族，在年改信了天主教。华伦斯坦希望通过协助皇帝及其天主教盟友来扩张他所拥有的土地，他很快展露出作为一名帝国军队优秀将领的才能，并由此获得嘉奖。诸多军事胜利和对波希米亚北部地区的吞并为华伦斯坦在17世纪20年代中期赢得了弗里德兰公爵的名衔。随着丹麦加入战斗站在新教君主这一边，而华伦斯坦帮助击败了克里斯蒂安四世的丹麦军队，他的军事作用和威望随之增长，为此华伦斯坦还被赐予梅克伦堡公国。
年，斐迪南二世颁布了归还教产敕令，重新激发了宗教争论，该敕令命令归还自年以来所有被挪用的天主教土地，并且通过禁止加尔文教徒进行礼拜来胁迫新教教徒。随后的一年，担心华伦斯坦的动机并且对他的雇佣军规模有所顾虑的天主教和新教君主说服皇帝解除了华伦斯坦的军事指挥官职务。然而，瑞典人对帝国将军蒂利伯爵的胜利一一蒂利本人也于年在莱赫阵亡一一以及萨克森人对波希米亚的入侵，迫使皇帝恢复华伦斯坦的统帅职位。曾经占领布拉格的萨克森人被赶出了波希米亚，随后华伦斯坦转向与古斯塔夫阿道夫二世统帅的瑞典军队作战。华伦斯坦于年11月在昌岑的一次重大战役中与瑞典人遭遇，尽管陷入困境的华伦斯坦被迫退至波米亚，新教事业却由于古斯塔夫阿道夫战死而遭到了重大挫折。出于追逐他自己的利益，华伦斯坦开启了与萨克森还有法国、瑞线和一些捷克流亡者的秘密协商，很有可能是希望获得他自己的独立含地，也可能是为了追逐波希米亚王位。帝国当权者对华伦斯坦的野心和动机渐生怀疑，皇帝再一次解除他的统帅职务，同时叛国罪的指控地开始流传。年2月25日，在海布要塞，华伦斯坦被他自己手下的名军官谋杀，这么做是出于对统帅叛国的愤怒。
对于波希米亚王国来说，三十年战争的最后阶段以瑞典年在波希米亚和年在摩拉维亚的军事行动为标记。哈布斯堡家族与特兰西瓦尼亚协商了一份和约，瑞典人离开了摩拉维亚。年，瑞典军队回到布拉格，围攻这座城市，在这个过程中掠夺布拉格城堡和鲁道夫二世的艺术收藏。学生志愿兵把守横跨伏尔塔瓦河的石桥，抵抗瑞典人，而犹太人团体保卫了部分堿墙，并且最终为抵抗努力提供了帮助。腓特烈三世用临时减轻税负和兑付被拖延的军需物资款项来奖赏布拉格的犹太人，不过这些福利被年的犹太人特许证抵消，该特许证对犹太人的权利和特权设置了限制。
年，《威斯特伐利亚和约》的签订正式结東了三十年战争，而在神圣罗马帝国，《奥格斯堡条约》（年）的条款被恢复并扩展以包含加尔文教派。在“谁的统治，谁的信仰＂（curiusregio，eiusreligio）的原则指导下，宗教和平允许单个统治者决定整个人口的宗教信仰。尽管农民没有权利去选择，其他国民可以皈依官方信仰或者离开。对捷克流亡者来说，将年定为基准年意味着他们将不能回到他们的祖国。天主教在波希米亚的胜利推动了这个王国反宗教改革的成功，不过凭借与萨克森的协议，西里西亚的路德教派信徒保住了礼拜的权利。
对于波希米亚来说，三十年的战事带来了经济混乱，同时因为冲突、饥荒、疾病和移民或流亡，人口数量急剧减少。由于士耳其战争期间匈牙利的分裂，波希米亚成为哈布斯堡王朝各领地中最大的一个，即使是在年失去上下西里西亚的情况下。在城镇里，由于战争对城市及其经济活动的挫伤，许多市民面临着贫困或财务困境。对于波希米亚农村来说，土地向教会或者高等贵族的转让使得低等贵族占有的土地减少到10％，而仅仅一个世纪前，他们还在占有土地总和上胜过大贵族。差不多90％的人口以从属农民的身份生活在天主教会和贵族阶层占有的土地上，同时“二等农奴”在中欧的延续意味着在西欧已经消失或者即将被废弃的封建习俗的留存。作为年失败的农民起义的结果，利奥波德一世（~-年在位）再次确认了长期存在的劳役（robota）需求，那就是要求农民每周按惯例有三天为地主服务，或者在农忙期间干满七天。
在文化背景上，波希米亚与欧洲天主教国家的重新连接使得巴洛克风格和其他影响渗入捷克国士。在反宗教改革的精神里，复兴的天主教堂推动了17世纪晚期的巴洛克风格，通过一种甚至可以触及普罗大众的强大而有活力的途径，把它作为激励宗教热情的手段。波希米亚的巴洛克建筑展现了意大利和奥地利大师的格调，不过也有本地建筑师的灵感，比如克里斯托弗·丁岑霍菲和他的儿子基连·伊格纳兹丁岑霍菲，其中位于布拉格小城由后者设计的圣尼古拉教堂被认为是波希米亚巴洛克杰作。哈布斯堡统治者利奥波德一世和约瑟夫一世（-年在位）统治下的巴洛克时期在艺术上是多产的，不过主要的贡献在艺术和建筑领域，而不是文学领域。
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